稳定细胞株构建
CHO-K1 Q 宿主以及配套载体来源明确且拥有授权，它们源自欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC ）的野生型 CHO-K1 细胞。表达载体是 pKS001，采用谷氨酰胺合成酶（GS）作为筛选标记，筛选压力为甲硫氨酸亚砜胺（MSX）；采用电转的方式，电转效率能达到 90% 或更高；在信号肽优化、筛选标记设置以及密码子优化方面具备丰富的经验。
CHO-K1 Q 宿主以及配套载体来源明确且拥有授权，它们源自欧洲细胞培养物保藏中心（ECACC ）的野生型 CHO-K1 细胞。表达载体是 pKS001，采用谷氨酰胺合成酶（GS）作为筛选标记，筛选压力为甲硫氨酸亚砜胺（MSX）；采用电转的方式，电转效率能达到 90% 或更高；在信号肽优化、筛选标记设置以及密码子优化方面具备丰富的经验。
采用Minipool筛选方式，结合有限稀释法，按照0.4个细胞每孔进行操作，并使用单克隆拍照仪器（如CSI、Cell Metric CLD、Nyone等）进行拍照，追踪单克隆生长图像，完全符合中美申报要求。
从构建DNA质粒到获得高表达的稳定细胞株，周期为4 - 6个月，同时能满足PDL60细胞株生长表达稳定性与遗传稳定性的要求。
抗体、双抗、融合蛋白单克隆细胞株等的表达量一般为3.0 - 8.0 g/L，摇瓶、3L和200L反应器的表达量一致性较好 。
稳定细胞株构建流程
服务案例
服务内容
阶段 | 项目 | 内容 |
1 | 4个分子构建* | 序列分析、信号肽设计、基因合成和表达载体构建、转染用质粒制备 |
2个分子瞬转评估和制备 HTRF 标准品 | 使用构建好的质粒进行瞬转表达，评估表达量，纯化后检测 SEC 和CE，用做蛋白检测标准品 | |
2个Minipool的建立和筛选* | 进行两轮共 2-4 次转染，每次转染铺10 块96 孔板，进行细胞群加压筛选、细胞群的表达量评估和蛋白质量评估 | |
| Top Minipool进行material生产 （可选） | 提供3L或者50L反应器用于培养表达量最高的Mininpool，收获的样品进行精纯并检测蛋白质量：SEC-HPLC、nrCE-SDS、rCE-SDS等参数（可接受标准为：SEC-HPLC>95%，Endotoxin<0.5EU/mg） |
| 单克隆筛选 | 经 titer 检测和拍照数据，筛选约40个单克隆进行 Fed-batch，挑最好的 3 个克隆确定产品序列无误，初步建立摇瓶批次补料培养工艺 |
2 | 原始细胞库的建立 | Top 3克隆每个克隆建立 25 支原始细胞库，其余所有细胞株冻存4-6 支。复苏检测原始细胞库的一致性，进行无菌和支原体的检测 |
| 细胞株稳定性实验 | 符合中、美 IND 申报要求的细胞株稳定性试验：开展不低于 60PDL 的细胞株稳定性研究（含加压传代和PDL30 后撤压传代两组），PCB、PDL15（MCB/mMCB）、PDL30（WCB/mWCB）、PDL45、PDL60 进行 fed-batch 实验，包括细胞生长稳定性，产物表达稳定性（可接受标准为：表达量下降不超过30%，质量不发生显著变化） |
3 | 英文报告（可选） | 细胞株构建报告、原始细胞建库和稳定性报告英文版 |
4 | Top 3克隆的反应器评估（可选） | 使用现有平台工艺评估不同克隆在3-15L生物反应器中的表现 |
5 | 申报材料撰写（可选） | 符合 CTD 格式的以上内容申报资料撰写 |
服务说明
备注说明：若是诊断试剂客户需构建稳定细胞株服务，客户给到氨基酸序列到构建bulk pool费用20-25万。需根据客户要求表达量来确认交付，一般溪长生物能保证挑选到单克隆表达量达4g/L。
交付材料
宿主细胞证明性文件
宿主细胞溯源性文件（采购合同、发票、宿主细胞来源报告等）
细胞株构建报告
含载体构建、转染、细胞群筛选、单克隆细胞株筛选和 Top3 克隆反应器评估（如有）过程描述和实验结果。
原始细胞库建库及稳定性报告
含原始细胞库建库和细胞株稳定性实验过程描述和实验结果。
产品交付
细胞株构建过程中冻存的所有minipool、单克隆细胞株以及原始细胞库，如涉及蛋白表达生产，则还包括根据要求要付的蛋白样品。
文件资料
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